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细胞生长的检查方法(二)
浏览次数:965发布日期:2016-06-23

1.检测细胞代谢活性

检测细胞的代谢活性也可以反映细胞增殖的情况。在细胞增殖过程中乳酸脱氢酶的活性会增加,而活性的脱氢酶可以使得外源性的四唑盐或者阿尔玛蓝(Alamar blue)还原成为带有颜色还原产物。通过分光光度计或者酶标仪来读取含染料培养基的吸光度,从而衡量细胞的代谢活性,检测细胞增殖的情况。

四种zui常见的四唑盐是:MTT、XTT、MTS和WST1,其还原产物为甲瓒(formazan)。

(1)四甲基偶氮唑盐法(MTT):MTT商品名为噻唑蓝,是一种黄色的染料。1983年Mosmann建立MTT比色法,用于检测细胞存活和增殖。其原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为不溶于水的蓝紫色结晶,甲瓒并沉积在细胞中,而死亡的细胞无此功能。二甲亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒,用酶联免疫分析仪测定其光吸收值,可间接反映活细胞数量。在一定细胞数量范围内,MTT结晶形成的量与细胞数成正比。MTT可以用于所有细胞类型,但MTT在标准的细胞培养基中是不溶的,而且其生成的甲瓒晶体需要溶解在DMSC)中。因此,MTT主要作为终点检测方法。另外,有研究发现过氧化物会降低MTT测定的准确度,抑制将近95%,的MTT与O2-的反应,MTT溶解产物甲瓒会吸附在纳米纤维上,而致使检测的结果呈现假阴性。

(2)二甲氧唑黄比色法(XTT):XTT是一种与MTT类似的四唑氮衍生物,可被活细胞还原形成水溶性的橘黄色的甲瓒产物,不形成颗粒,可直接用酶联免疫分析仪检测吸光度,故较MTT法更加快速、简便、敏感。

但XTT水溶液不稳定,需要低温保存,现配现用。由于XTT的代谢产物呈橘黄色,故培养体系中有些黄色代谢物和试剂可能会影响其检测结果。与MTT一样,过氧化物可抑制近95%的XTT与O2-的反应,故对XTT测定的准确度有一定的影响。

(3)内盐法(MTS):MTS是一种新型的MTT类似物。MTs在偶联剂PMS存在的条件下,可被活细胞线粒体中的多种脱氢酶还原成水溶性的有色甲瓒产物,其颜色深浅与活细胞数量在一定范围内呈高度相关,可用酶标仪检测。它的优点在于无放射性、快速、安全、方便、灵活及特异性强,同时又克服了MTT、XTT的缺点。

(4)四唑单钠盐法(WST-1):WST-1是水溶性四唑盐试剂,是一种类似于MTT的化合物,在电子耦合试剂存在的情况下,可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的甲瓒。细胞增殖越多越快,则颜色越深;细胞毒性越大,则颜色越浅。WST-1是MTT的一种升级替代产品,和MTT或其他MTT类似产品如XTT、MTS等相比有明显的优点。首先,MTT被线粒体内的一些脱氢酶还原生成的甲瓒不是水溶性的,需要由特定的溶解液来溶解:而WST-1和XTT、MTS产生的甲瓒都是水溶性的,可以省去后续的溶解步骤。其次,WST-1产生的甲瓒比XTT和MTS产生的甲瓒更易溶解。再次,WST-1比XTT和MTS更加稳定,加入WST-1显色后,可以在不同时间反复用酶标仪读板,使检测时间更加灵活,实验结果更加稳定。另外,WST-1和MTT、XTT等相比,线性范围更宽,灵敏度更高。

(5)Cell countjn譬kit-8(CCK-8):CCK-8试剂中含有WST-8。WST-8是近年新开发的一种较WST-1更新的水溶性四唑盐,检测原理与WST-1类似,但较WST-1更稳定,灵敏度更高,溶解性更强,更易于保存。CCK-8检测细胞增殖、细胞毒性实验的灵敏度比MTT、XTT及MTS更高,尤其适合于悬浮细胞,高通量药物筛选。CCK-8法细胞毒性低,细胞检测后还可重复利用,具有更好的实用性,可替代MTT法,具有良好的应用前景。

(6)阿尔玛蓝法:阿尔玛蓝检测试剂为细胞增殖和细胞毒性检测提供了一种简便、快速、可靠、安全的方法。阿尔玛蓝在氧化状态下呈现紫蓝色无荧光性,而在还原状态下转变为呈粉红或红色荧光的还原产物,可以用普通分光光度计或荧光光度计进行检测,吸光度和荧光强度与活性细胞数成正比。阿尔玛蓝对细胞无毒、无害,不影响细胞代谢、细胞因子分泌、抗体合成等,可以对同一批细胞的生长状态进行连续观察和进一步的实验。

MTT可以用于所有细胞类型,但MTT在标准的细胞培养基中是不溶的,而且其生成的甲瓒晶体需要溶解在DMSO中。因此,MTT主要作为终点检测方法。其他三种盐与阿尔玛蓝一样,都是可溶且无毒的。它们可以作为连续监控手段来跟踪细胞增殖的动态改变。其中XTT的效率较低,需要添加额外的因子。而WST-1更灵敏有效,与其他盐相比能够更快显色。阿尔玛蓝的灵敏度也很高,只要微孔板的孔中有100个细胞它就能够检测到。四唑盐和阿尔玛蓝氧化还原染料能够用于多种仪器和高通量研究,非常方便。

2.检测ATP含量

ATP是细胞能量的直接来源,细胞内的ATP含量受到严格的调控,死亡细胞或即将死亡的细胞几乎不舍ATP,在细胞溶解物或提取物中测得的ATP浓度与细胞数之间存在严格的线性关系。因此,检测ATP也可以得到细胞增殖的信息。

ATP检测可以用成色反应、荧光、化学发光或同位素等方法实现。目前应用zui广的方法基于萤火虫荧光素酶(催化荧光素氧化,消耗ATP。如果有ATP存在,则荧光素就会发光,发光效率极高,发光量与ATP含量呈很好的线性关系,可以反映细胞内ATP的含量。

3.活细胞荧光标记

羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯(CFSE)是一种可穿透细胞膜的荧光染料,CFSE能够轻易穿透细胞膜,在活细胞内聚积并与胞内蛋白共价结合,水解后的CFSE释放出荧光物质,这些共价结合的荧光物分子很少从细胞内脱落。CFSE标记后的细胞用于体内观察可以长达数周。当细胞分裂时,CFSE标记荧光可平均分配至两个子代细胞中,因此其荧光强度是亲代细胞的一半。这样,在一个增殖的细胞群体,各连续代细胞的荧光强度呈对数递减,利用流式细胞仪在488nm激发光和荧光检测通道可对其进行分析。

4.增强标记检测

增殖细胞特异性地表达某些特定蛋白,利用特异性的单抗来识别这些增殖细胞。例如,在人体细胞中,Ki-67,PCNA等可以作为细胞增殖的标志。但是,由于需要组织切片,这种方法无法进行高通量分析。不过这一方法颇受癌症研究者们的青睐,因为它能够用来检测体内肿瘤细胞的增殖。

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