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细胞生长的检查方法(一)
浏览次数:453发布日期:2016-06-23

1.直接计数法

是zui简单的检测细胞生长的方法。计数细胞一般利用台盼蓝(锥虫蓝染色,台盼蓝(锥虫蓝)不能透过活细胞正常完整的细胞膜,故活细胞不着色。而死亡细胞的细胞膜通透性增高,可使染料进入细胞内而使细胞着色。因此,镜下未染色细胞认为是活细胞,而染色细胞认为是死亡细胞。

经典的细胞计数常用到血细胞计数板。细胞消化成单个细胞后,将细胞悬液加入血盖片和计数板之间的空隙中,通常我们计数计数板的四角大方格(每个大方格又分16个小方格)内的细胞数。计完数后,需换算出每ml悬液中的细胞数。由于计数板中每一方格的面积为0. 01cm2,高为0. 01cm,这样它的体积为0. 0001cm3,即0.1mm3。由于1ml=1000mm3,所以每一大方格内细胞数×10 000=细胞数/ml,可按下式计算:细胞悬液细胞数/ml=4个大格细胞总数/4×10000。如计数前己稀释,可再乘稀释倍数。计数细胞后,可以根据细胞计数结果,以细胞数为纵坐标,以天数为横坐标绘制生长曲线。

目前也有多家公司生产自动细胞计数仪,如lifetechnology、Bio-rad等公司。自动计数仪将图像输入电脑后自动计数,消除了手动细胞计数的主观性,消除了用户之间的差异性,可以快速准确地计数细胞,并同时检测细胞存活率及平均大小。随着技术的不断进步,有公司也推出了直接计数细胞的分析仪器,如Roche旗下Innovatis公司的CASY系列细胞计数分析系统,CASY细胞计数仪采用独特的电脉冲三维扫描分析技术。它突破了传统二维细胞成像分析技术和染色法的局限,提供更加的细胞计数和分析功能。无需购买染色剂,即可、快速地定量细胞浓度、体积、成团和碎片。它根据测量的体积来计算细胞成团,即使是严重成团的细胞,它也能正确定量。细胞死亡时,细胞膜会破损,CASY测得的是细胞核的体积,根据体积大小的差别,我们可以区分活细胞、死细胞以及细胞碎片。

2.检测DNA合成

检测DNA合成是目前检测细胞增殖zui准确可靠的方法,目前常用的方法有如下几种:

(1)3H-胸腺嘧啶核苷渗入法(3H-TdR):胸腺嘧啶核苷(TdR)是DNA合成的前体物,处于S期的细胞不断地摄取TdR用以合成DNA。3H-TdR掺入法是将被放射性标记的3H-TdR掺入DNA合成期的细胞,细胞内3H-TdR掺入量的多少可客观反映细胞复制DNA能力的大小,从而问接了解细胞增殖情况。通过检测。H放射活性即可反映DNA含量。

1976年Mattem等首先采用此方法做体外药敏试验。此后经过长期的广泛研究,也己证实该法对各种动物肿瘤及人类肿瘤均有较好的预测价值和重复性,主要用于细胞增殖的检测与药物敏感性试验等。但这种方法操作复杂,试剂含有同位素,具有放射性,对实验者有一定的危害,故限制了它的应用。

(2)BrdU检测法:BrdU中文全名为5-溴脱氧尿嘧啶核苷,为胸腺嘧啶的衍生物,可代替胸腺嘧啶在DNA合成期(S期)掺入,而后利用抗BrdU的抗体耦联不同的酶,加入不同发光特性的底物,然后再通过比色法、化学发光检测或荧光信号检测底物强度等步骤,反映BrdU的掺入量。该方法不需要再和放射性物质打交道。

(3)EdU检测法:BrdU虽然解决了接触同位素的问题,但该方法需要变性DNA后才能与抗体结合,但这就破坏了DNA双链结构,对某些后续或同时进行的试验,如其他染料的结合染色有影响。现在有一种新的检测方法能避免这种情况的发生——EdU检测。EdU(5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷)也是一种胸腺嘧啶核苷类似物,但其连有的炔羟基团在天然化合物中很少见,在细胞增殖时能够插入正在复制的DNA分子中,基于EdU与染料的共轭反应可以进行快速的细胞增殖检测分析,可以有效地检测处于S期的细胞百分数。与传统的免疫荧光染色(BrdU)检测方法相比,更简单,更快速,更准确。

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