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蛋白质提纯技术简介
浏览次数:111发布日期:2016-06-13

1.逐级盐析 高盐情况下由于与蛋白质表面极性基团作用的水分子减少而使得蛋白质溶解度下降的现象称为盐析效应。不同蛋白质表面极性基团分布的不同决定对盐析效应的反应不同。如50%饱和度的硫酸铵能够沉淀血清中的抗体分子IgG,但是血清中其他类型的蛋白质需要更高的硫酸铵浓度才能被盐析。逐级盐析通常在蛋白质初步分离中用到。核酸在高盐溶液中不沉淀,所以盐析也是浓缩蛋白的同时去除蛋白质制各液中高丰度核酸污染源的好方法。常规的操作是:在常温搅拌的情况下慢慢加入饱和的硫酸铵溶液到初始上清液当中直到饱和度达到20%,然后把样品放在冷库4~6个小时后再离心。如此重复可得到在20%,40%,60%和80%硫酸铵饱和度情况下沉淀的蛋白质。各个组分的蛋白质可以在重新溶解和透析后检测目标蛋白的位置以指导下一步的提纯。

注:硫酸铵的饱和度在常温(24℃)和冷库(4℃)间变化很小,都是4。 lM左右(在1L纯净水中溶解761g硫酸铵晶体)。

2.亲和层析 亲和层析是基于目标蛋白和固相交联的载体之间的相互作用而设计的纯化策略。如可以利用含固相交联抗体的亲和柱纯化可与之作用的对应的抗原分子。另外,基于很多转录因子有对DNA特殊序列的亲和性,亲和层析也被广泛地应用于纯化转录因子的策略中:把含有和目标转录因子相互作用的DNA序列交联在活化琼脂糖固相柱上可以纯化对应的转录因子。这种方法的优点在于每一步的纯化倍数会很高,通常是上百倍或千倍。如果是基于抗体-抗原作用的亲和层析,被吸附的蛋白质可以用低pH、高pH或含尿素溶液(干扰抗体-抗原作用)洗脱;被吸附在DNA的转录因子则可以用含高盐缓冲液洗脱。

3.凝胶过滤层析 凝胶过滤层析又叫分子筛层析,是基于蛋白质天然分子量大小而设计的分离方法。分子筛的作用使得分子量小的蛋白质在层析过程中在柱子上滞留的时段比较长。所以。个特定蛋白质或复合体被洗脱所需的溶液体积与其天然分子量成负相关。这种方法不仅在初级或次级分离中是很好的手段,也可以与已知分子量的对照蛋白平行使用来测定纯化蛋白质的天然分子量。

4.离子交换层析 离子交换层析是zui常用的基于蛋白质与载体吸附作用而设计的蛋白质分离方法。蛋白质是表面带有多离子基团的大分子。离子交换层析足以离子交换剂为固定相,以特定的含蛋白质和溶液离子的缓冲液为流动相,利用离子交换剂对需要分离的各种蛋白质结合力的差异,而将混合物中不同解离特性蛋白质进行分离的层析技术。此方法具有灵敏度高,重复性与选择性好和分离速度快等优点。根据离子交换剂所带电荷的不同,可分为阴离子交换剂和阳离子交换剂。以阴离子交换层析为例:将交换树脂(因为交换剂能在溶液中释放出OH基团所以本身带正电荷)填充在层析柱内,表面带负电荷的蛋白质会被吸附;由于各种蛋白质表面所带电荷的种类和数量不同,它们被吸附的程度也不同。然后用含阴离子(如KCl中的Cl)梯度的缓冲溶液洗柱,蛋白质可依次从含电荷少到多的顺序被洗脱下来而达到分离的目的。

5.疏水作用层析 疏水作用层析也属于吸附层析一类。该方法基于蛋白质的疏水差异,适用于不易被盐析蛋白质的进一步提纯。在高盐溶液中,蛋白质表面的亲水/离子基团被反离子所遮盖,而表面的疏水基团会与疏水层析柱中的疏水配基相结合。通常而论,盐浓度越高,蛋白与层析柱的疏水配基相结合形成的疏水键越强。如在2. 5M硫酸铵条件下能被盐析的蛋白质可以溶解在含2M硫酸铵的缓冲液中加样。在洗脱时,将盐浓度逐渐降低(如建立2M到40mM硫酸铵梯度),不同蛋白质因疏水性不同而先后被洗脱而纯化。

注:疏水层析与离子交换层析刚好互补,因此可以用于分离离子交换层析或其他方法很难或不能分离的蛋白质。

6.反相层析 在上面所讲的吸附层析特别是离子交换层析中都会出现高极性物质在层析柱上吸附较牢从而发生洗脱时的拖尾现象和在柱中滞留时间过长的问题。反相层析是在固相载体上涂上一层高碳原子的疏水性强的烷烃类,而洗脱液则用极性强的溶剂,如甲醇和水的混合物。被分离的粗蛋白质样品中,极性强的蛋白质不容易被吸附,所以能zui先洗脱下来从而得到较好的分离效果。这种层析法与普通的吸附层析法相反,所以被称为反相层析。从本质上看,反相层析分离法与疏水层析分离法的依据是一致的,都是利用固定相载体上偶联的疏水性配基与流动相中包括蛋白质表面的一些疏水基团发生可逆性结合而进行分离。反相层析的优点是分辨率好。图4-3-2是例样。

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