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快速筛查农药制剂中非法杀虫剂
浏览次数:762发布日期:2016-09-14

原标题:超液相色谱?四极杆?飞行时间质谱法快速筛查农药制剂中非法添加的杀虫剂

摘要:建立了农药制剂中 48 种非法添加杀虫剂的超液相色谱?四极杆?飞行时间质谱(UPLC?Q?TOF MS)快速 筛查方法。 可湿性粉剂、乳油和悬浮剂 3 种剂型的农药制剂样品经甲醇溶解、提取后,采用 UPLC?Q?TOF MS 检测, 48 种杀虫剂在 0.5~ 20mg / L 范围内线性关系良好,线性相关系数(R)大于 0.99。 48 种农药的定量限为 0.05 ~ 0.4 mg / kg,检出限为0.01~ 0.2 mg / kg,低、中、高 3 个加标水平下的平均回收率为 86.3% ~ 101.5%,相对标准偏差 为 1.7% ~4.0%。 该方法快速、准确,可用于农药制剂中多种杀虫剂的快速筛查。

    非法添加成分是指在农药制剂中人为添加标称 有效成分以外的农药成分。 近年来,我国加强了对 有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂的管理,对甲胺磷等 高毒农药全面禁止生产和使用,对克百威等农药限 制在蔬菜、水果等作物上使用。

    而有些不法商 家为了增加防治效果、降低登记和生产成本、牟取暴利,在产品中非法添加高毒、禁限用的有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂。 使用含有非法添加杀虫剂的 农药制剂可能造成农药残留超标,影响农产品质量 安全,导致作物发生药害,给农民造成经济损失,对 生态环境造成污染。 近年来,农药制剂中非法添加 成分已引起各级农业主管部门的高度重视,成为监管的重要对象。

    我国有超过1100 种农药应用于农业生产, 农药制剂中已有的检测方法主要针对某一种或多种 有效成分的含量检测,主要有气相色谱(GC)法 、 液相色谱(LC)法、光谱法等。 非法添加成分 具有很强的隐蔽性和随机性,常规的 GC 法和 LC 法 无法应用于非法添加成分的检测。

    目前,文献报道 的农药非法添加成分的检测方法有气相色谱?质谱 (GC?MS) 法 、液相色谱?串联质谱( HPLC? MS / MS)法。 GC?MS 法不适用于难气化或者高 温下容易分解的农药,HPLC?MS / MS 法虽然灵敏度 高,选择性和特异性好,然而不能对化合物进行 相对分子质量(Mr)的测定,不能建立标准的质谱数 据库,在定性检测方面尚有一定的欠缺。

    超液相色谱?四极杆?飞行时间质谱( UPLC?Q?TOF MS)依据所测得化合物的相对分子质量,可以 对化合物进行定性,从而避免误检和漏检 , 并且可以建立标准的质谱数据库,能够对未知样品 进行快速、准确的筛查。 目前,UPLC?Q?TOF MS 广 泛应用于中成药和保健品、食品添加剂 、兽药和水产品等多个领域非法添加成分的 筛查。 作者尚未见到有应用 UPLC?Q?TOF MS 方法 筛查农药制剂中非法添加有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂的文献报道。

    本研究建立了可湿性粉剂( WP)、乳油(SC) 3 种农药制剂中 48 种有机磷和氨基甲酸酯类杀虫 剂的快速筛查方法,为打击在农药制剂中非法添加 杀虫剂提供了有力的。

一、实验部分

1. 仪器与试剂

    Agilent 1290 超液相色谱仪/ 6530 四极杆? 飞行时间质谱仪,MassHunter 工作站及定性分析软 件,PCDL个人谱图数据库软件; Zorbax C18柱(100 mm×1.8 mm, 2.1 μm,);超纯水机(美国 Millipore 公司)。

    克百威、丁硫克百威、硫双威、杀线威、特丁 硫磷、二嗪磷、灭线磷、甲拌磷、硫线磷、 马拉硫磷、喹硫磷、双硫 磷、稻丰散 等 13 种标准品购自北京标准物质网;甲萘威、甲胺磷、灭多威、速灭威 、乙酰甲胺磷 、涕灭威、异丙威、仲丁威、残杀威、氧乐果、敌 敌畏(、久效磷、甲基 硫环磷、乐果、杀螟丹、抗蚜威、 地虫硫磷 、水胺硫磷、乙嘧硫磷、辛硫磷、 杀扑磷、苯线磷、甲基嘧啶磷 、敌瘟磷 、氯唑磷、三唑磷、治 螟磷、甲基吡啶磷、甲基异柳磷 、毒死蜱、毒虫畏、蝇毒磷、伏杀硫磷、丙溴磷 等 35 种标准品购自北京标准物质网。 甲醇、乙腈为 LC?MS 纯试剂,甲酸为色谱纯试 剂,实验用水为超纯水。

    48 种杀虫剂单标准溶液的配制:称取农药标准品 10 mg(至 0.1 mg),置于 25 mL 容量瓶中, 用甲醇溶解并定容。

    实验样品从市场随机抽取。

2. 液相色谱条件

    色谱柱为 Zorbax C18柱;色谱柱温度为 35 ℃; 进样量为 1 μL。 流动相:A 相为 0.1% (v / v)甲酸水 溶液,B 相为乙腈;流动相流速为 0.3 mL / min。 梯 度洗脱程序:0 ~ 3.0 min, 10% B~ 40% B; 3.0 ~ 7.0 min, 40% B~ 90% B; 7.0 ~ 12.0 min, 90% B; 12.0 ~12.5 min, 90% B~10% B。

3. 质谱条件

    离子源:电喷雾离子(ESI) 源,正离子模式;扫 描范围:一级质谱 m/ z 150 ~ 500,二级质谱 m/ z 50 ~500;雾化气:氮气;雾化气流量:11 L / min;喷雾气 压力:3.4×10 Pa;干燥气温度 300 ℃;毛细管电压:3 500 V;碎裂电压 140 V;二级质谱碰撞能量分别 为:5、10、20 和 40 V。 UPLC?Q?TOF MS 配置了双 喷雾器电喷雾源,采集数据时可以连续导入参比溶 液,对仪器质量轴进行实时校正,参比离子为 m/ z 121.050 9 和 m/ z 922.009 8。

4. 数据库的建立

4.1 一级质谱数据库的建立

    采用 Agilent 公司的 PCDL 软件建立了 48 种有 机磷和氨基甲酸酯杀虫剂的一级质谱数据库。取标准溶液稀释至 2 mg / L,按照2 和3 节的液相色 谱和质谱条件进样。 采集一级质谱数据(TOF?MS 模式),得到目标化合物的保留时间、质量数等 信息,通过在 PCDL 软件中输入每种农药的中英文 名称、分子式、相对分子质量和保留时间,建立 了 48 种杀虫剂的一级质量数据库。

4.2 二级质谱数据库的建立

    一级质谱数据库建立完成后,对 48 种杀虫剂再 次进样测定,采集二级质谱图,通过 PCDL 软件建立 48 种农药的二级质谱库,二级质谱库中包含母离 子、保留时间、不同碰撞能量(5、10、20 和 40 V)下的 二级质谱图等信息。

5. 样品前处理

    我国登记和使用较多的农药制剂有可湿性粉剂、乳油、悬浮剂 3 种剂型,本实验对不同剂型的样品分别进行处理。

5.1 可湿性粉剂样品的处理

    准确称取 0。25 g 样品置于 25 mL 容量瓶中,加 入 15 mL 甲醇,超声溶解 10 min,冷却至室温。 用 甲醇定容至 25mL,然后转移到 50 mL 离心管中,以3500 r/ min 的速度离心 5 min,吸取 1 mL 上清液至 10 mL 容量瓶中,加入 4mL 乙腈,用水定容至 10 mL,过 0。22 μm 滤膜后进样测定。

5.2 乳油样品的处理

    准确称取 0.25 g 乳油样品,置于 25 mL 容量瓶 中,用甲醇溶解并定容,吸取 1 mL 溶液至 10 mL 容 量瓶中,加入 4 mL 乙腈,用水定容至 10 mL,过 0.22 μm 滤膜后进样测定。

5.3 悬浮剂样品的处理

    准确称取 0.25 g 悬浮剂样品,置于 25 mL 容量 瓶中,加入 5 mL 水,振摇,使样品均匀分散在水中。 然后加入 15 mL 甲醇,超声溶解 10 min,冷却至室 温。 用甲醇定容至 25 mL,吸取 1 mL 溶液至 10 mL 容量瓶中,加入 4 mL 乙腈,用水定容至 10 mL,过 0.22 μm 滤膜后进样测定。

二、结果与讨论

1. 样品前处理条件的选择

    农药制剂在加工的过程中,会根据剂型的不同 加入不同的助剂。 所以,根据剂型的不同,样品的前 处理方法也略有不同。

    可湿性粉剂在加工的过程中需要加入载体(如 硅藻土、高岭土)和助剂(如润湿剂、分散剂)等。 在 样品处理过程中,载体一般不溶解于甲醇,可通过离 心除去。 助剂在甲醇中有一定的溶解性,但不影响对农药的提取。 可湿性粉剂可以直接加入甲醇后超 声提取。

    乳油样品在加工的过程中加入了大量的有机溶 剂和助溶剂,如甲醇、乙腈、丙酮等溶剂,由于称取的 样品量较少,这些溶剂均可以溶解于甲醇中,对样品 提取没有影响。

    悬浮剂在加工的过程中加入了一些特殊的助剂 如分散剂、润湿剂等,如直接加入甲醇,样品容易聚 集,不利于提取。 因此在样品中先加入 5mL 水,使 样品均匀分散在水中,再加入甲醇超声溶解提取。

    对于这 3 种剂型的农药制剂,在提取过程中,一 些干扰物质如润湿剂、分散剂等也会被提取到甲醇 溶液中,这些物质对分离和测定有一定的影响,但是 由于非法添加杀虫剂的含量较高,样品经过提取后 需要稀释才能进样分析,干扰物质也同时被稀释,从 而减少了对分析测定的影响。经过比较,不经净化 处理的样品对测定基本没有影响,可直接进样分析, 从而减少了样品前处理造成的损失,提高了回收率。

2. 液相色谱条件的优化

    一般检测农药常用乙腈?水或甲醇?水两种混合 溶剂体系作为流动相,首先对这两种体系作流动相 进行了对比。 结果表明,使用乙腈?水体系做流动相 时,48 种杀虫剂的色谱峰形较好,峰形对称,响应值 也高于以甲醇?水为流动相时的响应值,采用乙腈? 水体系的压力较低,有利于色谱柱的寿命和仪器的 保护。 之后考察了酸对分离和灵敏度的影响,结果 表明,以乙腈?0。1% (v / v)甲酸水溶液为流动相得到 了zui优的峰形和色谱分离效果。 在流动相中加入 0。1% (v / v)甲酸,有助于提高化合物的离子化效 率,提高灵敏度。 因此选择以乙腈?0。1%(v / v)甲酸 水溶液作为流动相。

3. 质谱条件的优化

    采用正离子扫描模式,优化了 48 种杀虫剂的准 分子离子峰,选择强度大的准分子离子峰可以提高 分析的灵敏度和质谱数据库检索的稳定性与得分。 经过优化,在 ESI +模式下,水胺硫磷[M+Na]的强 度大于[M+H]的强度,其余 47 种农药的[M+H]强度zui大。如表 1 所示,为了实现对 48 种杀虫剂的 谱库检索定性检测,所获得的二级质谱图在高质量 区和低质量区的碎片都非常重要,因此,每种杀虫剂 均获得 4 个不同碰撞能量下的二级质谱图,在进行 谱库检索时,低碰撞能量的质谱图有利于判断主要 碎片,而高碰撞能量的质谱图可以得到更多质谱碎 片信息,能够更准确地实现对化合物的定性。 根据 试 验结果选择4个碰撞能量( 5、10、20和40 V) ,可以实现每种杀虫剂在高质量区和低质量区获得足 够的质谱碎片信息。 48 种农药的准分子离子[M+ H]或者[M+Na]的实测 Mr 和通过 Mr 计算软件 计算出的每种杀虫剂的理论 Mr 值见表 1。 按照前 述优化的条件对 48 种杀虫剂的混合标准溶液进行 检测,得到总离子流图(见图 1)。

4. 定性分析

    先对样品进行一级质谱全扫描,通过一级质谱数据库对采集到的一级质谱图进行自动检索,软件 根据实测离子与数据库中的保留时间、质量、同 位素分布和同位素比例等因素的匹配度进行综合评 分,将检索得分≥85 的样品确定为阳性样品。 再利 用二级质谱的碎片离子对阳性样品进一步确证。 样 品经过二次进样测定,对阳性样品中疑似非法添加 的杀虫剂进行二级质谱扫描,将采集到的二级质谱 图通过已建立的二级质谱数据库进行检索,根据离 子精度、同位素比例、同位素丰度等因素进行综合评 分,将得分≥75 的农药确定为非法添加的杀虫剂。

    为了考察本文所建立的筛查方法对 48 种杀虫剂筛查结果的可靠性,采用已建立的一级质谱数据 库和二级质谱数据库对样品中添加了 48种杀虫剂 的可湿性粉剂、乳油、悬浮剂样品进行自动检索,结果见表 1。

5. 线性关系、定量限、检出限、回收率和精密度

    配制 0.5~20 mg / L 范围的标准溶液,以化合物 的准分子离子峰作为定量离子,在本文所述的色谱 条件和质谱条件下进行测定,以提取离子色谱图的 峰面积(Y)为纵坐标、质量浓度(X, mg / L)为横坐 标进行回归分析。 结果表明,48 种杀虫剂的线性相 关系数R均大于 0.99,说明本方法适用于农药制 剂中 48 种杀虫剂的定量分析。 对筛查出的非法添 加杀虫剂进行定量分析时,使用宽度为 20×10 -6(20 ppm)的质量偏差对一级全扫描总离子流图提取离 子色谱图,采用外标法以提取离子色谱峰的峰面积 进行定量分析。

    以定量离子 10 倍信噪比(S / N)的响应值对应 的质量浓度为方法定量限(LOQ);以一级质谱数据 库检索得分≥85 和二级质谱数据库检索得分≥75 的筛查zui低质量浓度作为方法的检出限(LOD) (见 表 2)。 选择可湿性粉剂、乳油、悬浮剂空白样品进 行加标回收试验,选取 0。5、1。0 和 5。0 mg / kg 3 个添加水平,每个水平重复测定 3 次,48 种杀虫剂在 3 种剂型中的加标回收率为86。3% ~ 101。5%,相对标 准偏差(RSDs)为 1。7% ~4。0% (见表 2)。

6. 实际样品的筛查

    从上海郊区 9 个区(县)的农资门店抽取了 100 份样品,应用本方法进行快速筛查及含量分析,结果见表 3。 在 100 个样品中,有9个样品检出非法添 加的杀虫剂,9 份样品的一级质谱检索得分≥85,二 级质谱检索得分≥75,非法添加成分的含量均大于1%(质量分数)。

三、结 论

    建立了可湿性粉剂、乳油、悬浮剂等 3 种农药制 剂中 48 种杀虫剂的 UPLC?Q?TOF MS 筛查方法。 该方法具有快速、定性准确等优点,能有效避免样品 的误检和漏检,可以满足农药制剂中非法添加成分 的快速筛查和定量要求。 本次抽取的 100 份样品中 筛查出了我国在蔬菜、水果等作物上禁止或者限制 使用的农药,如克百威、灭多威、马拉硫磷等,这些农 药使用后,可能引起作物药害、农产品残留超标等一系列严重后果,危害到人民群众的身体健康和农民 的经济利益。 通过对非法添加成分的快速筛查,能 够从源头加强农药质量的管理,确保农产品质量安全和农民的利益,为相关的监管部门提供。(来源:北京标准物质网)   试剂、标准品:

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